导读
雷公藤（TwHF）作为治疗类风湿性关节炎（RA）和肾炎的中药已有数百年的历史。尽管TwHF治疗RA的疗效确切，但其严重的副作用和毒性也受到了国内外研究人员的密切关注，因此TwHF的临床应用一直存在争议。目前大多数TwHF毒性研究都是基于正常状态的动物进行的，但忽略了病理状态下的影响。在本研究中，我们旨在通过双向正交偏最小二乘法（O2PLS）找出TwHF对不同身体状态的大鼠肾脏“毒/效”的物质基础和代谢机制。在本研究中，我们以乙醇为提取溶剂，采用回流提取法提取TwHF。我们通过检测肌酐和尿素氮水平来评估TwHF对不同身体状态下大鼠肾脏的影响，并通过UPLC-Q-TOF/MS鉴定不同身体状态大鼠肾脏病理学中TwHF的成分；使用血清和尿液代谢组学来寻找TwHF发挥肾损伤和保护作用的生物标志物和代谢途径；最后使用O2PLS相关性分析来将成分与肾保护和损伤生物标志物相关联。结果发现TwHF在11.25g/kg/d的剂量下对RA大鼠的肾脏具有保护作用，对正常大鼠的肾具有损伤作用。UPLC-Q-TOF/MS技术鉴定出雷公藤提取物中的34种成分；在给药大鼠中鉴定出23种成分和57种代谢产物。O2PLS筛选出三种物质作为TwHF的毒性和药效成分，即3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol、kaurane-16,19,20-triol和demethylzeylasteral+O，我们发现这三种成分可能通过烟酸和烟酰胺代谢途径发挥肾毒性作用，并通过色氨酸代谢途径发挥肾保护作用。本研究首次采用O2PLS分析方法，结合体内生物标志物和成分，发现了TwHF肾毒性和疗效的物质基础和代谢机制，为进一步研究TwHF毒性和疗效生物学机制提供了关键线索。
论文ID
原名：Study on toxicity/efficacy related substances and metabolic mechanism of Tripterygium wilfordii Hook. f based on O2LPS correlation analysis
译名：基于O2LPS相关性分析探究雷公藤毒效相关物质及代谢机制
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.07
通讯作者：李遇伯，杨珍
通讯作者单位：天津中医药大学
实验设计
实验结果
1. 生化指标及病理检查
我们在大鼠中成功构建胶原诱导的RA模型，模型（M）组大鼠脚趾体积明显高于正常（NC）组（P < 0.05），TwHF处理（ML）组大鼠脚趾肿胀较M组减轻，有接近NC组的趋势，这表明给予TwHF后RA大鼠的病理状态有所改善（图1A）。与NC组相比，M组大鼠血清类风湿因子明显升高（P < 0.05）（图1B），M组大鼠踝关节的组织病理学切片显示踝关节间隙变窄、炎症细胞浸润和滑膜细胞增多症（图1C）。造模第8周，M组大鼠血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平较NC组明显升高（P < 0.05）（图1D），肾组织显示部分肾小球萎缩，并伴有肾间质炎性细胞浸润（图1E）。与M组相比，TwHF给药（ML）组的关节表面稍微光滑，组织结构的排列得到改善（图1C），血清肌酐和尿素氮水平显著降低（P < 0.05）（图1D）。肾脏病理学观察显示，ML组大鼠肾组织的病理变化显著改善，肾小球和肾小管萎缩数量减少，炎症细胞浸润减少（图1E）。正常大鼠给药6周后，ML组大鼠血清Scr和BUN均显著高于NC组（P < 0.05）（图1D），肾组织中出现一些肾小球小管萎缩和肾间质炎症细胞浸润等变化（图1E）。结果表明，TwHF对RA大鼠肾脏有保护作用，对正常大鼠肾脏也有一定的损伤作用。
图1 药效学结果
图ABC是评估RA模型的指标，图DE是评估肾脏药效学的指标。（A）各组大鼠脚趾体积的变化。（表示与NC组比较，*P<0.05；与M组比较，#P＜0.05）。（B）大鼠血清中类风湿因子的水平。（与NC组比较，*P<0.05；与M组比较，#P＜0.05）。（C）踝关节病理切片（40 × )。（D）不同组大鼠血清Scr和BUN水平的变化。（表示与NC组比较，*P<0.05；与M组比较，#P＜0.05）。（E）肾脏病理切片（400 × )。
2. TwHF体内外成分的鉴定
TwHF提取物的基峰离子流图如图2所示（图2），共鉴定出34种成分，包括10种三萜、15种二萜、7种酚类、1种生物碱和1种其他类别（表S1）。大鼠血清和尿液的基峰离子流图如补充材料所示（图S2和3）。我们在ML组血清中共鉴定出TwHF的12种成分和10种代谢产物，在尿液中共鉴定了13种成分和19种代谢产物。我们在NL组大鼠血清中鉴定出10种成分和28种代谢物，在尿液中鉴定出15种成分和15种代谢物（表1S2）。
图2 TwHF提取物的基峰离子流图
（A）TwHF提取物在正离子模式下的基峰离子流图。（B）TwHF提取物在负离子模式下的基峰离子流图。
表1 大鼠血清和尿液中TwHF的成分
缩写：S：血清；U：尿液；﹢:TwHF肾保护物质；﹣:TwHF肾毒性物质。
3. 血清和尿液代谢组学结果
为了观察RA大鼠给药后血清和尿液中内源性代谢产物的变化，我们对NC组、M组和ML组的血清和尿液样本进行代谢组学分析。主成分分析显示（图3），三组聚类可被区分，但没有很好地相互分离。于是我们使用OPLS-DA进一步分析。血清样品的OPLS-DA评分图和验证图（ESI+：R2X=0.625，R2Y=0.996，Q2=0.696，ESI-：R2X0.636，R2Y=0.986，Q2=0.483）以及尿液样本的OPLS-DA评分图和验证图（ESI+：R2X=0.667，R2Y=0.996，Q2=0.636，ESI-：R2X=0.0488，R2Y=0.982，Q2=0.574）（图3）显示NC组和M组之间有明显区别，表明建模后大鼠体内内源性代谢产物发生了变化，并且给药后ML组样品有向NC组样品靠近的趋势。
图3 TwHF肾脏保护作用的代谢组学结果
（A）NC、M和ML组大鼠血清中正离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA正离子模式评分图；正离子模式验证图。（B）NC、M和ML组大鼠血清中负离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA负离子模式得分图；负离子模式验证图。（C）NC、M和ML组大鼠尿液中正离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA正离子模式评分图；正离子模式验证图。（D）NC、M和ML组大鼠尿液中负离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA负离子模式得分图；负离子模式验证图。
表2 TwHF肾脏保护作用的生物标志物
缩写：a表示代谢物已被标准物质鉴定。S：血清。U：尿液。
我们比较正常大鼠给药前后血清和尿液中代谢产物的变化，对NC和NL大鼠的血清和尿液样本数据进行PCA分析，发现两组样本可以完全分离（图4）。在此基础上，我们进行了进一步的OPLS-DA分析，从血清评分图中（ESI+：R2X = 0.346，R2Y = 0.995，Q2 = 0.941，ESI-：R2X = 0.656，R2Y = 0.999，Q2=0.901）和尿液评分图（ESI+：R2X = 0.67，R2Y = 0.974，Q2 = 0.915，ESI-：R2X = 0.411，R2Y = 0.99，Q2 = 0.944）（图4）可以明显看出NC和NL组的血清样品具有更高的分离度，表明TwHF给药干预改变了正常大鼠血清中的代谢谱。我们对NC组和NL组之间的差异代谢产物进行筛选，以去除与肾保护生物标志物相同的代谢物，作为TwHF肾损伤作用的生物标志物。最后，我们共筛选出58种差异代谢产物，包括烟酰胺，作为TwHF肾损伤影响的生物标志物（表3）。
我们将筛选出的24种TwHF肾保护作用的生物标志物和58种肾损伤的生物标记物导入Metboanalyst 4.0中进行代谢途径分析，鉴定了一种与TwHF的肾保护作用相关的代谢途径（图S3A），即牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径，和7种与TwHF的肾损伤作用相关的代谢途径（图S3B），包括酪氨酸代谢途径。
图4 肾损伤影响的代谢组学结果
（A）NC组和NL组大鼠血清正离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA正离子模式评分图；正离子模式S-Plot；正离子模式验证图。（B）NC组和NL组大鼠血清负离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA负离子模式评分图；负离子模式S-Plot；负离子模式验证图。（C）NC组和NL组大鼠尿液正离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA正离子模式评分图；正离子模式S-Plot；正离子模式验证图。（D）NC组和NL组大鼠尿液负离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA负离子模式评分图；负离子模式S-Plot；负离子模式验证图。
表3 TwHF对肾脏损伤影响的生物标志物
缩写：a表示代谢物已被标准物质鉴定。S：血清。U：尿液。
4. O2LIS分析揭示了与TwHF毒性和疗效相关的物质及其代谢机制
为了探索TwHF对RA大鼠肾脏保护作用的物质基础，我们将筛选出的肾脏保护性生物标志物和ML组分结合起来进行O2PLS分析，并绘制评分图（图5A和B），载荷图显示了M组和ML组之间组间分散和组内聚集的趋势。我们筛选出VIP大于1的成分，并进行进一步的Pearson相关分析，并使用热图进行可视化（图6AB），相关系数|ρ|>0.7和VIP大于1时取交集。结果表明，血清中去甲泽拉木醛和Triptophenolidemethylether是TwHF肾保护作用的有效物质；雷酚内酯和原儿茶醛等15种化合物是与TwHF在尿液中的肾保护作用有关的有效物质（图7A）。
图5 TwHF组分肾脏保护和损伤作用的O2PLS分析
（A）血清中TwHF组分肾脏保护作用的O2PLS评分图和载荷图。（B）尿中TwHF组分肾脏保护作用的O2PLS评分图和载荷图。（C）血清中TwHF成分对肾损伤影响的O2PLS评分图和载荷图。（D）尿中TwHF成分对肾损伤影响的O2PLS评分图和载荷图。
图6 TwHF肾脏保护和损伤作用的生物标志物和大鼠成分的Pearson相关性分析
红色表示正相关，蓝色表示负相关。（A）血清中TwHF肾保护作用的生物标志物和成分的相关性分析。（B）尿中TwHF肾保护作用的生物标志物和成分的相关性分析。（C）血清中TwHF肾损伤作用的生物标志物和成分相关性分析。（D）尿中TwHF肾损伤作用的生物标志物和成分的相关性分析。
为探讨TwHF对正常大鼠肾脏毒性作用的物质基础，我们通过结合NL组中的肾损伤生物标志物和成分进行O2PLS分析，得分和载荷图如图所示（图5CD）。我们筛选出大于1的VIP成分，并进行进一步的Pearson相关性分析（图6CD），在血清中鉴定了tretinoin lactone Triptriolide+H2和其他9种TwHF引起肾损伤的物质，在尿液中鉴定了11种TwHF造成肾损伤的化合物，如16α-hydroxykauran-19,20-dioic acid（图7B）。
图7 TwHF发挥肾毒性和肾保护作用的机制分析
（A）TwHF肾脏保护的活性成分、生物标志物和代谢途径的网络图。（B）TwHF肾损伤的毒性成分、生物标志物和代谢途径的网络图。（C）TwHF中有毒有效物质作用机制的网络图。（D）TwHF发挥直接肾保护作用的代谢途径分析结果。（E）TwHF发挥直接肾毒性作用的代谢途径分析结果。
结果表明，3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol，kaurane-16，19，20-triol和demethylzeylasteral+O都是TwHF发挥的肾保护和肾毒性物质。Pearson相关性分析揭示，这三个成分与23种生物标志物（其中包括烟酰胺等18种肾损伤标志物，以及3-羟基邻氨基苯甲酸等5种肾保护标志物（图7C））的相关程度极高。将上述23个生物标志物导入MetboAnalyst 4.0，进行代谢通路富集分析并进行了可视化，我们发现3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol、kaurane-16，19，20-triol和demethylzeylasteral+O可能在身体疾病状态下通过色氨酸代谢途径发挥肾保护作用（图7D），并可能在身体正常状态下通过烟酸和烟酰胺代谢途径发挥肾毒性作用（图7E）。
讨论
中药是否具有毒性与身体的状态有关，为了研究中药的毒性，我们必须关注身体的生理状态。仅仅从健康状态研究中药的毒性是不可取的，我们还应该注意毒性中药在生物疾病状态下对身体的影响。TwHF是临床上常用的一种毒性中药，其独特的疗效一直受到临床工作者的重视，但也有因不合理使用而中毒的案例。一名健康的36岁男性在自行服用TwHF提取物3天后死亡，伴有呕吐、腹泻、肾衰竭、严重低血压和休克症状。在本研究中，我们使用正常和RA动物模型系统研究了“毒效”关系，并使用代谢组学结合O2PLS相关性分析来确定TwHF在不同身体条件下肾损伤和肾保护的物质和代谢途径。
代谢组学鉴定了24种肾保护作用的生物标志物和58种肾损伤作用的生物标志物。次黄嘌呤是嘌呤代谢中的重要代谢产物，嘌呤代谢异常引起高尿酸血症并以晶体依赖的方式诱导肾脏炎症。一项研究发现雷公藤甲素引起的肾毒性与次黄嘌呤代谢异常有关。Li等用氧嗪酸钾和次黄嘌呤建立高尿酸血症小鼠模型，结果显示模型组小鼠肾脏受损，血清CRE和BUN水平显著升高，肾小球萎缩。在本实验中，与NC组相比，ML组中次黄嘌呤（TwHF肾保护作用的生物标志物）水平减少，这表明TwHF可能通过调节次黄嘌呤代谢发挥其肾毒性作用。
3-羟基邻氨基苯甲酸是色氨酸的分解代谢代谢产物，以剂量依赖的方式抑制白细胞介素17的产生，因此起到抗炎剂的作用。Hou等人使用3-羟基邻氨基苯甲酸减轻实验性自身免疫性肾小球肾炎大鼠的肾损伤，发现它通过减少肾小球组织损伤和炎症细胞浸润来改善肾功能。结合本实验结果，M组3-羟基邻氨基苯甲酸含量较正常对照组下降，TwHF给药干预后3-羟基邻氨基苯甲酸含量增加，提示TwHF可能通过改变3-羟基邻羟基苯甲酸的代谢而发挥肾保护作用。
目前已经从TwHF中分离出几个具有重要生理活性的化合物。原儿茶醛是丹酚酸的一种。一些研究表明，原儿茶醛可以通过抑制蛋白激酶C通路变化引起的IL-1的产生来保护软骨。此外，原儿茶醛还具有一定的肾脏保护作用，可以通过抑制IncRNA9884诱导的炎症来缓解梗阻性肾病。16-羟基雷公藤内酯醇是一种二萜内酯环氧化物，一些研究人员利用巴豆油引起的小鼠耳肿胀模型和溶血素抗体测定了有效剂量、治疗指标和一定的安全系数，发现16-羟基雷公藤内酯醇具有良好的抗炎和免疫抑制活性。Tripterfordin是一种贝壳杉烷二萜内酯，可抑制原发性类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞中IL-6介导的炎症信号通路，并发挥抗RA活性。本研究从TwHF共鉴定出34个化合物，并且在TwHF给药的大鼠中发现了上述三种化合物，这表明TwHF在RA中的治疗活性可能通过这些物质发挥，此外原儿茶醛也是在大鼠尿液中发现的肾保护物质，提示原儿茶醛在治疗RA中发挥了治疗作用，同时对改善大鼠肾损伤有一定作用。雷公藤内酯乙和雷公藤酸A属于三萜类化合物，是TwHF的主要成分之一，也是毒性较大的物质。在本实验中，雷公藤内酯乙和雷公藤酸A是引起正常大鼠肾损伤的TwHF的毒性成分，并且我们在尿液中鉴定出雷公藤内酯乙的去甲基代谢产物，因此我们推测雷公藤内酯乙被吸收到血液中，然后发生去甲基化并作为代谢产物通过尿液排出。O2PLS相关分析显示，雷公藤内酯乙和雷公藤酸A与大鼠尿液中肾损伤标志物吲哚乙酸和4-苯基丁酸-O-硫酸盐呈高度正相关。
O2PLS分析结果表明，3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol、kaurane-16，19，20-triol和demethylzeylasteral+O是TwHF中同时具有肾毒性和肾损伤的物质。去甲泽拉木醛（T-96）是TwHF的活性成分之一，具有免疫抑制、抗炎和抗肿瘤的生物学活性。研究表明，T-96延长了肾移植大鼠的生存时间，具有明显的免疫抑制作用，在有效剂量范围内具有低毒作用。T-96减轻了红斑狼疮肾炎小鼠模型的炎症反应，改善了肾组织中的病变和炎症细胞浸润，同时抑制了肾脏中炎症因子如IL23、TNF-α和COX-2的表达。结合本实验的结果，T-96是与TwHF的肾保护作用有关的物质，我们在血清和尿液中都鉴定出T-96，T-96的去甲基代谢产物是在尿液中鉴定出的肾保护成分，因此我们推测T-96进入体内后，一部分进入血清，一部分通过尿液排出，在脱甲基代谢反应后通过尿液排出。Pearson相关分析发现T-96与尿液中的生物标志物龙胆酸呈正相关，M组大鼠尿液中龙胆酸水平下降，而ML组的水平倾向于与NC组的水平相似。尿液中物质含量的变化通常与肾脏的肾小球滤过率相关，因此可以推测模型化导致大鼠肾组织损伤从而影响尿液中龙胆酸的水平，TwHF给药后，T-96可改善肾组织损伤，龙胆酸含量接近正常水平，提示TwHF可能通过T-96发挥肾保护作用。
通过O2PLS分析，我们发现有23种肾损害代谢物和5种肾保护代谢物与3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol、kaurane-16，19，20-triol和demethylzeylasteral+O的代谢途径相关。研究发现，这些物质可能通过色氨酸代谢途径发挥肾脏保护作用，并通过烟酸和烟酰胺代谢途径发挥肾毒性。在色氨酸代谢途径中，过氧化氢酶（CAT）是过氧化氢和活性氮代谢的关键酶，氧化应激是肾损伤的重要机制，抗氧化酶的表达可以减少氧化应激，从而减轻肾损伤。一些研究人员通过CAT灌胃给药环孢菌素A（CsA）大鼠，与模型组相比，CAT给药大鼠的肾脏病理切片没有出现显著的病理变化，这表明CAT可以抑制CsA肾损伤的发展。研究还表明，提高CAT的活性可以直接发挥其抗氧化能力，从而减少肾损伤。因此，3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol、kaurane-16，19，20-triol和demethylzeylasteral+O可能通过调节色氨酸代谢途径中CAT酶的表达而发挥肾脏保护作用。
代谢组学结合O2PLS鉴定了烟酰胺可作为TwHF毒性和有效作用的生物标志物。烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）是烟酸和烟酰胺代谢途径中的关键酶，位于烟酰胺的下游。研究表明，NNMT过表达与许多肾脏疾病的发展密切相关，NNMT在肾癌（RCC）患者中高表达，当NNMT被敲低时，由于线粒体呼吸受损，RCC细胞的生存能力降低，表明NNMT是肾细胞癌的良好治疗靶点。结合目前的结果，3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol、kaurane-16，19，20-triol和demethylzeylasteral+O可能通过调节NNMT的表达从而调节烟酸和烟酰胺代谢途径而发挥肾毒性作用。
多项研究表明，肠道微生物及其代谢产物在各种疾病的发展中发挥着重要作用，因此，后续研究可以关注肠道微生物与TwHF的这种“有毒/有效”双向作用之间的关系，并更深入地探索其作用机制。
结论
本研究采用代谢组学和O2PLS相结合的方法，发现了TwHF对身体的毒性和有效物质，并解释了TwHF在不同身体状态下对大鼠肾脏的毒性和保护作用。结果表明，在大鼠病理状态下，TwHF中的3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol、kaurane-16，19，20-triol和demethylzeylasteral+O可通过色氨酸代谢途径发挥肾保护作用，以及在大鼠正常状态下通过烟酸和烟酰胺代谢途径发挥肾毒性作用，本研究可用于后续对TwHF的深入研究。本研究可为后续深入研究TwHF“毒/效”的生物学机制提供实验依据，并为解读循证用药在中医中的科学性和可行性提供新的研究思路，可以最大限度地减少药物不良反应，提高临床疗效，对中医药“毒/效”研究的现代化和国际化具有重要的现实意义。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37506782/
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